Cell Reports | 张纪岩团队揭示成年小鼠脑膜中造血干细胞的存在及特征

撰文 | 牛春晓，邹滔

责编 | 王思珍

编辑︱夏  叶

造血干细胞（hemopoietic stem cells，HSCs）存在于哺乳动物的胎肝、脐带血以及骨髓中，被称为“龛（niche）”的造血微环境所包围，可以通过自我更新和分化产生所有谱系的造血前体细胞。髓外造血通常作为一种病理性补偿发生于骨髓的造血功能遭到破坏或者不能满足机体需要的时候。近年来，有几篇组织居留造血前体细胞原位分化产生特定组织居留免疫细胞的报道，但是成年期多谱系的生理性髓外造血一直未被发现。

脑膜是包裹中枢神经系统的三层结缔组织膜，外层硬脑膜毗邻颅骨，内部包括蛛网膜和覆盖大脑皮层的软脑膜。最近，神经免疫学的快速进展揭示脑膜存在多种免疫细胞，包括髓样细胞和B细胞，因为连体共生小鼠实验说明脑膜髓样细胞和B细胞不是血源补充的，加上之前就有研究发现颅骨骨髓与硬脑膜间存在骨化的血管通道，主流观点推测这些脑膜免疫细胞来源于颅骨骨髓[1-3]，而另一研究通过改进的染料标记方法发现颅骨标记的B细胞并未出现于脑膜，从而驳斥了这种假设[4]。因此，脑膜免疫细胞的来源仍无定论。    

2022年11月08日，来自军事医学研究院的张纪岩团队在Cell Reports 上在线发表了题为“Identification of hematopoietic stem cells residing in the meninges of adult mice at steady state”的研究论文。该文章通过机械分离硬脑膜白细胞的方法，发现成年小鼠脑膜中存在HSCs，脑膜HSCs具有组织特异性表达谱，可为中枢神经系统提供更适应局部微环境的白细胞，扩充了我们对于生理性髓外造血的认知，也为脑膜免疫细胞的来源提供了一个更为合理的解释。

在本研究中，作者根据文献中单细胞测序提供的线索，推测硬脑膜存在HSCs，通用的酶解消化分离白细胞的方法可能会损伤这些细胞，导致这些细胞一直没有被检测到，于是研究人员通过机械分离的方法解离硬脑膜白细胞，然后进行流式分选获取非血源性的CD45+细胞进行10X单细胞转录组测序。除了发现与前人报道一致的细胞群，还聚类到一小群高水平表达造血前体标志物（如Kit、Cd34、Angpt1、Hlf和Ctla2a）的细胞，为了对这群前体细胞进行更详细的分析，研究人员再次从硬脑膜、颅骨和股骨中分选了Lin^-/lowc-Kit+细胞进行单细胞测序，富集到一群小鼠HSC标志物如Procr、Esam、Ly6a (Sca-1)明显富集，而Cd34和Cd48相对缺乏的细胞。有意思的是，HSCs具有组织特异性表达谱。GO_BP富集分析显示，与股骨HSCs相比，硬脑膜和颅骨HSCs更为相似，“mRNA加工”和“细胞质翻译”等生物合成过程表现出分子富集，并下调“对病毒反应”的相关转录。提示硬脑膜和颅骨HSCs比股骨HSCs更活跃，并在局部发挥不同的功能（图1）。

图1 小鼠脑膜单细胞测序与分析

（图源：Niu, et al., Cell Rep, 2022）

图2 小鼠脑膜HSCs及其下游前体细胞的表型鉴定

（图源：Niu, et al., Cell Rep, 2022）

接下来，流式细胞术证实机械分离的硬脑膜白细胞中存在HSCs，硬脑膜、颅骨和股骨白细胞中LSKs (Lin^-/lowSca-1⁺c-Kit⁺) 和HSCs (Lin^−/lowSca-1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48⁻) 的比例相似，但LKs (Lin^−/lowSca-1⁻c-Kit⁺) 在硬脑膜中最低，在股骨中最高。因为脑膜白细胞总数较少，硬脑膜中LKs、LKs和HSCs的数量均明显低于股骨和颅骨。免疫荧光分析显示，在硬脑膜中存在血管外CD150⁺Lin/CD48^−/low细胞，大部分沿窦分布。此外，硬脑膜和颅骨HSCs表达细胞分裂标记Ki67的比例更高，表明它们确实比股骨HSCs更活跃（图2）。与作者预先推测一致的是，酶解分离脑膜白细胞的方法会让LKs和HSCs消失（图3）。对脑膜HSCs功能的研究主要通过集落形成和移植实验，集落形成实验是一种有效的体外评估HSCs及其下游前体细胞数量和功能的方法，而多谱系重建和自我更新能力被广泛认为是HSCs最重要的特征。实验结果表明颅骨和硬脑膜白细胞体外产生pre-B集落的能力与股骨白细胞相似，但产生髓样集落数量较少。同时短期(8周)和长期(20周)的一代移植实验和二代移植实验表明，硬脑膜HSCs确实具有长期的、多谱系的造血重建和自我更新能力（图4）。

图3 酶解消化法和机械分离法对脑膜HSCs的不同影响

（图源：Niu, et al., Cell Rep, 2022）

图4 小鼠脑膜HSCs及其下游前体细胞的功能鉴定

（图源：Niu, et al., Cell Rep, 2022）

图5 小鼠脑膜造血微环境的发生发展与局部维持机制

（图源：Niu, et al., Cell Rep, 2022）

进一步，作者探讨了脑膜造血微环境的发生发展，通过流式细胞术揭示了HSCs在小鼠出生后1-7天定植于颅骨骨髓腔，而大部分硬脑膜HSCs的定植发生在出生7天以后。免疫荧光的结果与此一致。通过将新生鼠硬脑膜进行总体转录组测序，发现生后一天的脑膜即表达所有骨髓造血所需的niche分子，并且部分分子的表达量在出生1-2周后进一步升高。为了探讨脑膜HSCs局部维持机制，作者通过手术成功构建WT/GFP以及CD45.1/CD45.2连体共生小鼠，表明在内稳态条件下，共生鼠之间的HSCs没有实质上的交换。但将其中的WT鼠进行3Gy低剂量的辐照，而连体的GFP鼠用铅砖进行保护，流式分析表明WT鼠各处HSCs中的GFP+细胞比例增加，说明血源补充提高。放射线不仅造成HSCs减少，还导致血管通透性升高，为了明确血管通透性对于脑膜HSCs血源补充的影响，研究人员在CD45.2雌性连体小鼠中诱导了实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，然而在模型鼠脑实质和脑膜血管出现明显渗漏的情况下，脑膜HSCs的血源补充并没有增加（图5）。因此，成年鼠脑膜HSCs的维持依赖于局部微环境，仅在数量减少时血源补充才增加。

图6 成年小鼠脑膜中存在HSCs，可以为中枢神经系统提供更适应局部微环境的白细胞

（图源：Niu, et al., Cell Rep, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究揭示了稳态成年小鼠脑膜中具有HSCs，这些HSCs在小鼠出生后7到14天左右定植、呈现出特异性转录谱，并且具有多谱系重建和自我更新的能力，仅在其局部数量减少时才会从血液中得到补充（图6）。该文章为中枢神经系统免疫微环境的研究提供了新思路。但值得注意的是，该研究未探讨人的脑膜是否存在HSCs，也未能明确“颅骨-硬脑膜通道”在脑膜HSCs植入和局部维持中的可能作用。针对组织特异性的HSCs表达谱，还不清楚是特异的HSCs植入颅骨和脑膜，还是同样的HSCs植入不同部位，但是在局部表达谱被微环境逐渐改变。脑膜niche分子表达细胞与HSCs的空间定位、相互作用也需要进行分析。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36351383/

军事医学研究院张纪岩研究员为该文通讯作者，助理研究员牛春晓和于吉军、博士生邹滔为共同第一作者。张纪岩研究员也是北京脑科学和类脑研究中心的双聘研究员。该研究得到了国家自然科学基金(81930027，92169207，81625010)的资助。团队招考正式列编文职人员，要求学位：博士，详情咨询曹老师[e-mail]，具有神经生物学背景者优先。

第一作者：牛春晓（左一），于吉军（左二），邹滔（右一）；通讯作者：张纪岩（右二）

（照片提供自：张纪岩团队）

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Cugurra A, et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs from the meninges and CNS parenchyma. Science. 2021. 373: eabf7844.[2] Brioschi S, et al. Heterogeneity of meningeal B cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 2021. 373: eabf9277.[3] Wang Y, et al. Early developing B cells undergo negative selection by central nervous system-specific antigens in the meninges. Immunity. 2021. 54: 1–11.[4] Schafflick D, et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nat. Neurosci. 2021. 24: 1225–1234.

本文完